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多重PCR反应中关键因素与实验步骤

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多重PCR反应中关键因素与实验步骤 PCR 缓冲液(KCl )的浓度 . PCR 缓冲液的比较 (Step 5, B–D). KCl 或 PCR 缓冲液浓度 . 提高 PCR 缓冲液的浓度为 2x (或仅将 KCl 的浓度增加到 100mM )可以提高多重 PCR 的效率 (Figure 4d 及 Figure 3, d–f) ,这种调节作用比调节 DMSO ,甘油或 BSA 更重要。通常产生长片断扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好,而产生短片断扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好,高盐浓度会使长片断扩增产物难于变性解链 ( 比较 Figure 4d 中 0.4x 缓冲液与 2.8x 缓冲液 ) 。例如, sY94 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 在缓冲液的浓度为 0.8x 时扩增效果优于 sY88 引物对 ( 熔点为 58 ℃ ) 和 sY151 引物对 ( 熔点为 52 ℃ ) ,但在高的盐浓度条件下, sY94 引物对的扩增效果无明显优势。合适的缓冲液浓度可以克服产物大小和 GC 含量等因素的影响。 PCR 缓冲液的比较 . 我们还比较了原先提到的被称为 DMD 的多重 PCR 缓冲液和相对简单的 KCl 缓冲液在多重 PCR 反应中的差异。 5x 的 DMD 缓冲液含有 83 mM(NH 4 ) 2 SO 4 , 335 mM Tris-HCl (pH8.8), 33.5 mM MgCl 2 , 50 mM β -mercaptoethanol (β-巯基乙醇)和 850 μ g/mL BSA ,缓冲液 DMD 的使用终浓度为 1x ,与 10% DMSO 和 1.5 mM each dNTP 同时使用 (1,2,4) 。实验表明用 1.6x 的常规 KCl 缓冲液比用 DMD 缓冲液扩增 DMD 基因 ( 引物混合物 X-1) 效果更好,明显见到更多的 PCR 产物 (Figure 4e) 。实验结果使用病人的 DNA 样品做了十二次重复,重复性很好。 KCl 缓冲液相对简单,便于调节和优化实验。低 dNTP 浓度时 Taq DNA 聚合酶的保真性更高 (9) 。使用 KCl 缓冲液(要求更少的 dNTP )有利于对 PCR 产物做进一步的突变分析。 模板 DNA 的量和 Taq DNA 聚合酶 ( 步骤 5, A 和 D). 当每 25 μ L 反应体积中 DNA 的模板量为 30ng 到 500ng 时,混合物 Y-3* 未表现出明显差异 (Figure 4f) ,然而当模板量低于 30ng 时,某些 PCR 产物的量会减少。当模板量很低时( pg 级的 DNA ),扩增的效率与特异性可以通过进一步降低退火温度来优化,有时甚至要降低 10 ℃ –12 ℃(数据未显示)。使用引物混合物 Y-3(Figure 5a) 来测试不同 Taq DNA 聚合酶的浓度 (Perkin-Elmer) 。 Taq DNA 聚合酶的最适浓度为每 25 μ L 反应体积中 0.4 μ L 或 2U 。也许是由于 Taq DNA 聚合酶中甘油浓度过高,加入过多的 Taq DNA 聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高。在 1.6xPCR 缓冲液中使用自制的五种不同来源的 Taq DNA 聚合酶(每 25 μ L 反应体积中加入 2U )对 Y-4 引物混合物的反应体系扩增得到了相似的结果 (Figure 5b) 。 佐剂的使用: DMSO, 甘油 , BSA (Step 5E). 许多作者建议使用浓度范围为 5%–10% (v/v) 的 DMSO 和甘油来改善扩增的效率(提高产物量)和特异性(没有非特异性产物) (9) 。然而在多重反应中, DMSO 的使用会给出矛盾的结果。例如, 5% DMSO 增加了某些基因的产物量,减少了另一些基因的产物量,而对某些基因却没有任何影响 (Figure 5c) 。使用 5% 的甘油也得到了相似的结果。因此, DMSO 和甘油的调节对实验结果的影响要根据具体的实验来摸索。加入浓度达 0.8 μ g/ μ L BSA (比以前描述得更高)比加入 DMSO 和甘油更能提高 PCR 扩增的效率。 BSA 对任何基因的扩增都未产生抑制作用。
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